F IDENT IF ST EMA A e sis p re se n d gar de tra enos Aire UNI Fa c ulta d De p a rt FICACI A DE SE AGROB nta d a p a d e Bue no Lic. Lo D D abajo: Fu es, 2009 VERSIDA d d e Cie n ta me nto IÓN Y C CRECIÓ BACT E a ra o p ta r s Aire s e n...
moreF IDENT IF ST EMA A e sis p re se n d gar de tra enos Aire UNI Fa c ulta d De p a rt FICACI A DE SE AGROB nta d a p a d e Bue no Lic. Lo D D abajo: Fu es, 2009 VERSIDA d d e Cie n ta me nto IÓN Y C CRECIÓ BACT E a ra o p ta r s Aire s e n orena DI Dra . Áng DIRECC Dra . Da n Conseje Dr. Luis und a c ió AD DE BU nc ia s Exa o d e Quí CARAC ÓN DE ERIUM T r a l título n e l á re a Cristi IRECCIÓ g e le s Zo r CIÓN ASI nie la Ma ero de e Que sa d n Institut UENOS A a c ta s y N ímic a Bio CT ERIZA PROT E TUMEFA d e Do c to Químic a na Ha ÓN: rre g uie ta IST ENT E: rta Russo estudios: d a Allué to Le lo ir IRES Na tura le o ló g ic a ACIÓN EÍNAS T ACIENS o r d e la U a Bio ló g ic aurigot a o e s N DE UN T IPO I E S Unive rsid a c a t N EN a d A mis p a d re s, Fe ric a Sc hwe nd e r e Hira m Ha urig o t A Ma rtin Ha urig o t y Le yla Ha urig o t A Jua n Ma nue l Ca lvo AGRADECIMIENT OS A la Dra . Áng e le s Zo rre g uie ta p o r d irig ir e sta te sis y b rind a rme la p o sib ilid a d d e ha c e rla e n su la b o ra to rio . Po r e nse ña rme e l va lo r d e l tra b a jo , a c o nfia r e n mi misma y a no d e ja rme ve nc e r p o r ning ún o b stá c ulo , p o r imp o sib le q ue p a re zc a . Po rq ue sup o fomentar mi cr eati vi dad dándome mucha l iber tad l o que pr omovió mi cr ecimiento p ro fe sio na l y p e rso na l. Po r to d o Ang e le s, muc ha s g ra c ia s! A mi c o d ire c to ra Dra . Da nie la Russo , g ra c ia s Da ni p o r ta nta p a c ie nc ia , p o r e sc uc ha rme y a c o mp a ña rme e n mo me nto s ta n d ifíc ile s y a le nta rme sie mp re , p o r a yud a rme y e nse ña rme . A Jime na Be rni y Ale ja nd ro Ra b o ssi, no p ue d o má s q ue a g ra d e c e rle s c o n to d o mi c o ra zó n. Gra c ia s p o r se r mis a mig o s, mis c o nse je ro s y p o r a yud a rme ta nto , p o r a c o mp a ña rme y a le g ra r e l d ía a d ía . Uste d e s fue ro n e l mo to r q ue me p e rmitió lle g a r ha sta a c á . A la Dra . Ana Ma ría Ste lla , e xc e le nte p ro fe so ra y a mig a . A Jua n Ca rlo s Ca lvo . A lo s la b o ra to rio s q ue c o la b o ra ro n y a p o rta ro n a e sta te sis: Dr. G o ld b a um (FIL), Dr. Pito ssi (FIL), Dr. Sa nta Co lo mma (FIL), Dr. Wa p p ne r (FIL), Dr. Q ue sa d a Allué (FIL), Dr. Etc he niq ue (FCEN). A lo s a mig o s q ue c o se c he e n e sto s a ño s q ue me ha n so p o rta d o p a c ie nte me nte , Le a nd ro Ma rtíne z To sa r, Ed g a rd o Sa lva tie rra , Guille rmo Ta mine lli, Va nina Alzo g a ra y, Gusta vo G e e rke n, Pa b lo Nike l y Silvia Ag üe ro y a lo s a mig o s q ue e stá n d e sd e sie mp re Jime na Be rni, So le d a d Ale ssa nd ro , Ho ra c io Pa d ula , Ja vie r Lo mb a rd i, Ana lía Ro mb o lá y So ra ya Pe re z Rullá n. A Alic ia Ullo a , p o r e sta r a l e mp e za r y a l te rmina r, G ra c ia s Ali! A Susa na Ca rrillo p o r c o nte ne rme d ura nte e sto s a ño s. A mi fa milia Ma rtin, Le yla , so b re to d o a mi ma ma , mi e je mp lo d e muje r, d e a mo r y d e p a c ie nc ia , g ra c ia s ma mi. Mis tío s Guille rmo y Luc ia Sc hwe nd e r y Anita Sc hwe nd e r. Lo s q ue ya no e stá n p e ro sig ue n sie mp re c o nmig o , mi p a p a y mi he rma no Ma rc e lo y a mi so b rinito s a ma d o s Ma nue l, Fe d e ric o , Ag ustín y Ab ril, sie mp re le d ie ro n a le g ría a mi vid a . A Go nza lo , c o n to d o mi a mo r. A mi a mo r, Ma nue l, g ra c ia s mi vid a p o r e sta r c o nmig o y a c o mp a ña rme . A la Ag e nc ia Na c io na l d e Pro mo c ió n Cie ntífic a y Te c no ló g ic a , AL CONICET y a la FIL. A lo s q ue no a g ra d e zc o p untua lme nte p e ro sie mp re e stuvie ro n a hí, a p o rta nd o su e sfue rzo y b ue na vo lunta d p a ra q ue p ud ie ra ha c e r mi tra b a jo . Esp e ro no o lvid a r a na d ie . A to d o s muc ha s g ra c ia s… Identificación y caracterización de un Sistema de Secreción de Proteínas T ipo I en Agrobac te rium tume fac ie ns RESUMEN Lo s Siste ma s d e Se c re c ió n d e Pro te ína s tip o I (T1SS) p e rmite n a una a mp lia va rie d a d d e b a c te ria s G ra m-ne g a tiva s se c re ta r p ro te ína s a l me d io e xtra c e lula r; e sto s siste ma s p a rtic ip a n e n va ria s re sp ue sta s fisio ló g ic a s c o mo la a d a p ta c ió n a l me d io a mb ie nte y c o ntrib uye n a la virule nc ia e n d ive rso s p a tó g e no s. Lo s T1SS e stá n fo rma d o s p o r un c o mp o ne nte d e me mb ra na inte rna (ABC) un c o mp o ne nte d e fusió n d e me mb ra na (MFP) y un c o mp o ne nte d e me mb ra na e xte rna (OMF). Lo s g e ne s d e lo s d o s p rime ro s (e inc lusive e l OMP) sue le n e sta r fo rma nd o un o p e ró n y p ue d e n e sta r a d ya c e nte s a lo s g e ne s q ue c o d ific a n sus p ro te ína s sustra to . En la b a c te ria simb io nte Rhizo b ium le g umino sa rum, e l T1SS, PrsDE, e s re sp o nsa b le d e la se c re c ió n d e d ive rsa s p ro te ína s q ue p a rtic ip a n e n la sup e rvive nc ia d e l rizo b io e n e l sue lo , fa vo re c ie nd o la fo rma c ió n d e e struc tura s c o munita ria s d e no mina d a s b io films. A. tume fa c ie ns e s un fito p a tó g e no d e a lto inte ré s a g ro nó mic o y b io te c no ló g ic o . A p e sa r d e la re le va nc ia q ue lo s TISS mue stra n te ne r e n d ive rsa s bact er i as Gr am negat i vas , has t a l a fecha no s e ha avanz ado en el es t udi o y l a re le va nc ia fisio ló g ic a d e e sto s siste ma s d e se c re c ió n e n e ste fito p a tó g e no . En e ste tra b a jo , se a isló a p a rtir d e una b ib lio te c a g e nó mic a p ro ve nie nte d e A. tume fa c ie ns e l c ó smid o p IJ7760 q ue fue c a p a z c o mp le me nta r e l fe no tip o d e se c re c ió n d e c e p a s muta nte s e n e l siste ma PrsDE d e R. le g umino sa rum. Se d e te rminó q ue d ic ho c ó smid o a lb e rg a lo s g e ne s d e un siste ma ho mó lo g o a l q ue se d e no minó Asp D-Asp E, Ag ro b a c te rium se c re tio n pro te in D a nd E) fo rma d o p o r un c o mp o ne nte ABC (d o minio d e unió n a ATP) y o tro MFP (p ro te ína d e fusió n d e me mb ra na s), re sp e c tiva me nte . Este siste ma fue re sp o nsa b le d e la se c re c ió n d e una p ro te ína , a la q ue se d e no minó Hla , d e func ió n d e sc o no c ida c o d ific a d a rio a rrib a d e a sp DE. El a ná lisis d e la s se c ue nc ia s d e l c ó smid o p e rmitió id e ntific a r, río a rrib a d e hla , g e ne s c uyo p ro d uc to s p re se nta n a lta similitud d e se c ue nc ia a mino a c íd ic a c o n re c e p to re s d e he mo (d e no mina d o hla R) y a fa c to re s sig ma y a nti sig ma (d e no mina d o s hla S y hla I). La s zo na s p ro mo to ra s d e a mb o s lo c i p re se nta ro n se c ue nc ia s c o nse nso d e re c o no c imie nto d e l re g ula d o r RirA q ue re sp o nd e a la c o nc e ntra c ió n d e hie rro e xtra c e lula r. Rio a rrib a d e e sto s g e ne s se id e ntific ó un p ro b a b le siste ma ABC d e c a p ta c ió n d e he mo (d e no mina d o a huUVTB) q ue p re se nta e n su re g ió n p ro mo to ra se c ue nc ia s d e re c o no c imie nto d e RirA y d e l re g ula d o r d e l me ta b o lismo d e l he mo IrrA. El a ná lisis d e la s p ro te ína s p re se nte s e n e l me d io e xtra c e lula r e n d ive rsa s c o nd ic io ne s d e c ultivo y nutric io na le s p e rmitió re fle ja r un c o mp le jo c o ntro l y una re g ula c ió n d ife re nc ia l d e la se c re c ió n d e la p ro te ína Hla e n e l ho sp e d a d o r sustituto R. le g umino sa rum A34 y A. tume fa c ie ns C58. Se o b se rvó una muy e le va d a se c re c ió n d e Hla e n e l ho sp e d a d o r sustituto R. le g umino sa rum A34 e n me d io s ric o s d e c ultivo . Se d e te rminó q ue e sta d e sre g ula c ió n se d e b e a q ue la c e p a d e A34 c o ntie ne una muta c ió n a nc e stra l e n a lg ún re g ula d o r d e sc o no c id o ha sta la fe c ha q ue p ro vo c a un fe no tip o p le io tró pic o . Este re g ula d o r e s c o d ific a d o e n e l p lá smid o simb ió tic o p RL1JI y re g ula , la se c re c ió n d e Hla . El e stud io d e la re g ula c ió n e n e l p a rie nte he te ró lo g o R. le g umino sa rum mo stró q ue la se c re c ió n d e Hla ta mb ié n se ve re p rimid a p o r lo s re g ula d o re s g lo b a le s d e re sp ue sta a hie rro d e sc rip to s e n Rhizo b ia c e a e , RirA e IrrA. Po r o tro la d o , e l a g re g a d o d e he mo g lo b ina c o mo fue nte d e he mo e xtra c e lula r, ind ujo la se c re c ió n d e Hla c o mo p ro te ína ma yo rita ria e n e l c o nte xto he te ró lo g o d e Rhizo b ium. El a ná lisis d e l c o nte xto g e né tic o d e hla mo stró q ue e ste g e n e stá inc luid o e n un lo c us sinté nic o a o tro s c luste rs d e g e ne s invo luc ra d o s e n la c a p ta c ió n d e he mo a tra vé s d e he mó fo ro s, a unq ue Hla no p re se nta similitud d e se c ue nc ia a mino a c íd ic a c o n he mó fo ro s c a ra c te riza d o s. Sin e mb a rg o , la p urific a c ió n p o r c o lumna d e a finid a d d e he mina mo stró q ue Hla p re se nta c a p a c id a d d e unir he mina y se ría e l p rime r he mó fo ro d e sc ripto e n la fa milia Rhizo b ia c e a e . Me d ia nte muta g é ne sis d irig id a se g e ne ró una muta nte d e se c re c ió n e n a sp D d e A. tume fa c ie ns C58. Lo s fe no tip o s a so c ia d o s a e sta muta nte mo stra ro n un c a rá c te r p le io tró p ic o , ta nto la a uto a g re g a c ió n b a c te ria na , la a d he sió n a so p o rte a b ió tic o y la mo tilid a d e n a g a r se vie ro n a fe c ta d a s. En A. tume fa c ie ns la se c re c ió n d e Hla re sp o nd ió p rinc ip a lme nte a c o nd ic io ne s mic ro ó xic a s/ a nó xic a s, a d e má s d e a la a use nc ia d e hie rro y p re se nc ia d e he mo . Inte re sa nte me nte , la muta nte d e fic ie nte e n la se c re c ió n d e Hla fue inc a p a z d e ind uc ir la fo rma c ió n d e tumo re s e n Ka la nc ho e sp. En c o njunto , lo s re sulta d o s p re se nta d o s e n e ste tra b a jo sug ie re n q ue e l T1SS Asp DE, p a rtic ip a ría e...